熒光定量PCR儀是一種用于實(shí)時(shí)監測PCR擴增過(guò)程中產(chǎn)物的儀器。其原理基于熒光染料或探針與目標DNA序列結合后產(chǎn)生的熒光信號,通過(guò)實(shí)時(shí)檢測熒光強度的變化,可以實(shí)現對PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)監測和定量分析。
熒光定量PCR儀的主要組成部分包括光學(xué)系統、溫度控制系統、樣品處理系統和數據處理系統。以下是其實(shí)現對PCR產(chǎn)物實(shí)時(shí)監測的過(guò)程:
1、熒光染料或探針的選擇:熒光定量PCR實(shí)驗中,需要選擇合適的熒光染料或探針與目標DNA序列特異性結合。常用的熒光染料有SYBRGreenI和SYBRGold,它們能非特異性地結合到雙鏈DNA上,發(fā)出熒光信號。而探針類(lèi)熒光標記物如TaqMan探針、MolecularBeacon等,則是通過(guò)特異性地結合到目標DNA序列上,發(fā)出熒光信號。
2、樣品制備:將待測樣本、引物、熒光染料或探針、PCR反應液等混合在一起,加入到PCR管中。然后將PCR管放入熒光定量PCR儀的樣品槽中。
3、PCR循環(huán)過(guò)程:溫度控制系統會(huì )按照預設的程序,對樣品進(jìn)行升溫、降溫,實(shí)現PCR循環(huán)過(guò)程中的變性、退火和延伸階段。在每個(gè)循環(huán)的退火和延伸階段,光學(xué)系統會(huì )激發(fā)熒光染料或探針產(chǎn)生熒光信號,并通過(guò)檢測器實(shí)時(shí)檢測熒光強度。
4、數據處理與分析:數據處理系統會(huì )實(shí)時(shí)記錄每個(gè)循環(huán)中熒光信號的變化,并將其轉化為擴增曲線(xiàn)。通過(guò)對擴增曲線(xiàn)進(jìn)行分析,可以得到目標DNA序列的起始拷貝數、擴增效率等信息,從而實(shí)現對PCR產(chǎn)物的定量分析。
5、結果輸出:通常會(huì )將實(shí)驗結果以表格、圖形等形式展示出來(lái),方便實(shí)驗者進(jìn)行后續分析和判斷。
總之,熒光定量PCR儀通過(guò)熒光染料或探針與目標DNA序列結合產(chǎn)生的熒光信號,實(shí)現了對PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)監測和定量分析。這使得熒光定量PCR技術(shù)在基因表達分析、病原體檢測、遺傳變異分析等領(lǐng)域得到了廣泛應用。