技術(shù)文章
導讀:普通農夫的谷倉里肯定沒(méi)有款的HiSeq測序系統。不過(guò),這并不意味著(zhù)新一代測序(NGS)在農業(yè)領(lǐng)域就不如醫學(xué)領(lǐng)域那么重要。
喬治亞大學(xué)的特聘教授A(yíng)ndrew Paterson就利用NGS來(lái)捕獲群體的多樣性,他將基因型與參考基因組進(jìn)行比較。他領(lǐng)導的植物基因組作圖實(shí)驗室也利用NGS從不同個(gè)體中獲得許許多多的許可,“這樣我們可以了解誰(shuí)和誰(shuí)關(guān)系比較近”。
不管是研究玉米,還是研究小鼠,傳統的遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和生物化學(xué)、生物信息學(xué)以及其他學(xué)科中的許多技術(shù)都是一樣的。然而,植物為研究人員帶來(lái)了一些*的挑戰和機遇。
多倍體
植物可能攜帶了基因組的多個(gè)拷貝,比如說(shuō),面包小麥是六倍體,而甘蔗的拷貝數多達200個(gè)。“即使是四倍體,我們都很少有高質(zhì)量的參考序列,更不用說(shuō)六倍體了,”HudsonAlpha生物技術(shù)研究所的Jeremy Schmutz談道。誠然,亞基因組之間有足夠的差異,讓你將大多數基因與每條染色體的不同特點(diǎn)相關(guān)聯(lián),但并非全部。Schmutz說(shuō),有很多東西,你無(wú)法說(shuō)出它們從哪里來(lái),到哪里去,因為有太多的拷貝。甘蔗就更不用說(shuō)了。
通常情況下,人們對親本或祖先種或者模式生物開(kāi)展遺傳學(xué)和基因組學(xué)分析。短柄草(Brachypodium)的基因組就特別小;它常作為小麥或其他草類(lèi)的替身。“重測序小麥可能需要Illumina HiSeq X Ten的半個(gè)流動(dòng)槽,這相當于5個(gè)人類(lèi)基因組。而短柄草只有350 Mb,因此你可以盡情測序,”Schmutz說(shuō)。你可以誘導突變,測定表型,如果你發(fā)現了一些有趣的,可以看看小麥中的相同基因做了什么。
參考呢
目前zui的植物基因組是水稻基因組,這主要是因為“我們使用了非常非常小心的BAC-by-BAC方法。我們利用Sanger測序對每個(gè)BAC(細菌人工染色體)進(jìn)行單獨測序,”亞利桑那基因組研究所的Rod Wing教授談道。這個(gè)基因組于2005年發(fā)表。
Wing還參與了玉米基因組的測序,這也是通過(guò)BAC-by-BAC開(kāi)展的。不過(guò)那時(shí),“我們沒(méi)有足夠的資金來(lái)完成每個(gè)BAC,因此*完成的是真正的基因部分,”Wing解釋道。zui近,人們利用短讀取技術(shù)測序了基因組,產(chǎn)生了缺乏大部分非編碼區域的基因組組裝。
NGS的zui大問(wèn)題之一是短讀取無(wú)法很好地對付重復片段,這可能占了基因組的一半?,F在有一種技術(shù)能夠很好地應對,南伊利諾伊大學(xué)的David Lightfoot教授談道,那就是PacBio的長(cháng)讀取技術(shù),它往往能夠跨過(guò)重復區域。Lightfoot的研究團隊正準備發(fā)表橄欖樹(shù)基因組,這就是結合短讀取和長(cháng)讀取測序的。
高分子量DNA
BAC、長(cháng)讀取測序、matepair文庫構建,以及其他一些方法,都需要相對高分子量的DNA。“對于血液樣本而言,這很容易獲得,但是對植物來(lái)說(shuō)有點(diǎn)難,因為它們積累了碳水化合物以及其他的代謝產(chǎn)物,可能降解DNA,”Schmutz說(shuō)。此外,葉綠體可能貢獻了10% 的DNA。去除它們,“這樣你就不會(huì )一而再、再而三地把錢(qián)浪費在葉綠體的重測序上,”Lightfoot說(shuō)。他使用了各種方法,包括在黑暗中育苗(這也能去除淀粉),從根部取樣,或者使用現成的試劑盒來(lái)分離細胞核。
Wing的團隊不依賴(lài)試劑盒,而是裂解并離心細胞,然后用溫和的去污劑(如Triton™ X100)重懸沉淀,裂解葉綠體和線(xiàn)粒體,但保持細胞核完整。“然后你就可以取出細胞核,純化出高分子量的DNA,用于PacBio或長(cháng)讀取測序,”他說(shuō)。為了制備BAC文庫,他的團隊將DNA嵌入低熔點(diǎn)瓊脂糖中,創(chuàng )造出DNA多孔袋,讓純化DNA的酶和試劑可在其中擴散。DNA則永遠不會(huì )受到任何剪切力。
新應用
目前,植物基因組學(xué)中的大部分經(jīng)費都用來(lái)生成參考基因組。下一步是尋找作物的多樣性,并查看它們的野生親緣種。“在馴化過(guò)程中,你可能經(jīng)歷了消除所有變異的過(guò)程,不過(guò)事實(shí)證明,這種變異有望解決許多的農業(yè)問(wèn)題,”Wing說(shuō)。密歇根州立大學(xué)的Rebecca Grumet教授及其團隊正在尋找葫蘆科的抗病遺傳標記(QTL),特別是西瓜、甜瓜、黃瓜和南瓜,這zui終將幫助育種者輕松篩查抗病品種。遺傳標記能幫助育種者混合多個(gè)性狀,抵抗多種疾病,還能帶來(lái)其他的優(yōu)良性狀。
她的團隊是利用兩種測序法基因分型(GBS)來(lái)實(shí)現的。*種是基于雙親交配:將抗病株與敏感株雜交,查看后代。它們都有全基因組參考序列,因此能夠找出性狀所在的位置。第二種是GWAS:他們計劃對每種作物的1000個(gè)種質(zhì)資源進(jìn)行測序,特別是它起源的區域。他們將利用這些信息來(lái)了解多少遺傳多樣性是來(lái)自那里,并建立核心種質(zhì)。
此外,許多其他的NGS技術(shù),比如RNASeq,也將在植物學(xué)研究中大顯身手。如今測序已經(jīng)扎下了根,而隨著(zhù)成本繼續下降,新一代的研究人員更加熟練,它的應用必將開(kāi)花結果。
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