技術(shù)文章
導讀 | 重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA),被稱(chēng)為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)。本專(zhuān)題為大家詳細介紹RPA的原理、引物設計、疑難解答以及在致病菌檢測、病毒檢測以及癌癥研究中的靈活應用。 |
自PCR技術(shù)誕生以來(lái)已經(jīng)有三十年了,從經(jīng)典PCR、實(shí)時(shí)定量PCR再到現在的數字PCR,這一技術(shù)在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。很多人的實(shí)驗根本離不開(kāi)PCR。筆者曾經(jīng)也接觸PCR很長(cháng)一段時(shí)間,加樣、設置程序、等待、檢測。這些過(guò)程看起來(lái)容易,但實(shí)驗結果卻總是會(huì )出人意料,很多時(shí)候根本不知道是哪里出了錯。那么要是有一款技術(shù),它比PCR更快速、便捷、,你會(huì )感興趣嗎?
RPA是什么?
基本原理
重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA),被稱(chēng)為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)。RPA技術(shù)主要依賴(lài)于三種酶:能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性,zui適反應溫度在37°C左右。
重組酶與引物結合形成的蛋白-DNA復合物,能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就會(huì )發(fā)生鏈交換反應形成并啟動(dòng)DNA合成,對模板上的目標區域進(jìn)行指數式擴增。被替換的DNA鏈與SSB結合,防止進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中,由兩個(gè)相對的引物起始一個(gè)合成事件。整個(gè)過(guò)程進(jìn)行得非???,一般可在十分鐘之內獲得可檢出水平的擴增產(chǎn)物。
圖片來(lái)源:Isothermal amplified detection of DNA and RNA
引物設計
RPA分析的關(guān)鍵在于擴增引物和探針的設計。PCR引物多半是不適用的,因為RPA引物比一般PCR引物長(cháng),通常需要達到30-38個(gè)堿基。引物過(guò)短會(huì )降低重組率,影響擴增速度和檢測靈敏度。在設計RPA引物時(shí),變性溫度不再是影響擴增引物的關(guān)鍵因素。RPA的引物和探針設計不像傳統PCR那樣成熟,用戶(hù)需要自己摸條件進(jìn)行優(yōu)化。
優(yōu)勢
常規PCR必須經(jīng)過(guò)變性、退火、延伸三個(gè)步驟,而PCR儀本質(zhì)上就是一個(gè)控制溫度升降的設備。RPA反應的zui適溫度在37℃-42℃之間,無(wú)需變性,在常溫下即可進(jìn)行。這無(wú)疑能大大加快PCR的速度。此外,由于不需要溫控設備,RPA可以真正實(shí)現便攜式的快速核酸檢測。
據介紹,RPA檢測的靈敏度很高,能夠將痕量的核酸(尤其是DNA)模板擴增到可以檢出的水平,從單個(gè)模板分子得到大約1012擴增產(chǎn)物。而且RPA還用不著(zhù)復雜的樣品處理,適用于無(wú)法提取核酸的實(shí)地檢測。
RPA既可以擴增DNA也可以擴增RNA,還省去了額外的cDNA合成步驟。你不僅可以對擴增產(chǎn)物進(jìn)行終點(diǎn)檢測,還可以對擴增過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監控,甚至可以通過(guò)試紙條(側流層析試紙條LFD)讀取結果。
RPA可以用來(lái)干什么?
RPA對硬件設備的要求很低,特別適合用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業(yè)等領(lǐng)域。以下為大家介紹RPA在細菌、病毒檢測以及癌癥研究等領(lǐng)域的應用情況。
RPA成為致病菌檢測的得力工具
在今年發(fā)表的一系列文章中,RPA技術(shù)被廣泛用于艱難梭狀芽孢桿菌、結核桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、沙門(mén)氏菌、大腸埃希菌STEC等常見(jiàn)致病菌的檢測。在臨床診斷和食品安全方面,為人們提供了簡(jiǎn)單快速的實(shí)地篩查方案。(這篇文獻之前報道過(guò),在這里就不詳述了。)[詳細]
RPA技術(shù)建立沙眼衣原體快速檢測方法
沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis)感染是zui常見(jiàn)的性傳播疾病之一。沙眼衣原體影響5-10%的人口,常見(jiàn)于小于25歲的成年人。目前廣泛使用的沙眼衣原體檢測方法是以聚合酶鏈反應(PCR)技術(shù)為基礎,這種方法只適合于經(jīng)過(guò)專(zhuān)業(yè)訓練的人員在具有特定儀器的實(shí)驗室使用。
日前,發(fā)表在《分子診斷雜志》(The Journal of Molecular Diagnostics)雜志上的一項研究中,研究人員利用RPA技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種檢測沙眼衣原體的快速、靈敏的新方法,利用該方法在20分鐘內即可得出檢測結果。[參考文獻]
研究人員利用RPA技術(shù)直接從患者尿液樣本中檢測沙眼衣原體,不需要從尿液樣品提取總DNA,也不需要專(zhuān)門(mén)的儀器設備。而且該檢測方法還具有少費力、少耗時(shí)、更經(jīng)濟等特點(diǎn)。與目前的沙眼衣原體檢測方法比較而言,該方法還能夠顯著(zhù)提高檢測的敏感性和特異性
RPA檢測瘧原蟲(chóng)
澳大利亞科學(xué)家捕捉到瘧原蟲(chóng)入侵并摧毀人體紅細胞畫(huà)面
核酸擴增是目前zui靈敏的瘧原蟲(chóng)(P. falciparum)特異性檢測法。然而,PCR需要熱循環(huán)設備和專(zhuān)業(yè)性操作,資源匱乏的地區往往難以滿(mǎn)足這些條件。在這種情況下,與側流層析結合的RPA有著(zhù)很大的應用前景。
《Malaria Journal》雜志今年三月份發(fā)表的一項研究中,研究人員將RPA基礎反應、TwistAmp nfo探針和側流層析結合起來(lái),實(shí)現了瘧原蟲(chóng)18S rRNA基因的高靈敏度快速檢測。在38°C的條件下,只需要不到十分鐘的擴增,就能檢出含有四個(gè)瘧原蟲(chóng)的樣本。加上側流層析的檢測時(shí)間,整個(gè)流程總共只需要15分鐘,而且肉眼可以直接看到檢測結果。
研究人員用不同瘧原蟲(chóng)測試了這種方法的靈敏度和特異性。研究顯示,所有瘧原蟲(chóng)都被成功檢出,所有非瘧原蟲(chóng)都得出了陰性結果。文章指出,這一方案將大大改善資源匱乏地區的瘧原蟲(chóng)分子診斷。[參考文獻]
RPA檢測冠狀病毒
2012年在中東鑒定的中東呼吸綜合癥冠狀病毒( Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)是一種新型的冠狀病毒。這種病毒很快傳入了歐洲,給公共安全機構敲響了警鐘。
目前,MERS-CoV檢測主要依賴(lài)于實(shí)時(shí)RT-PCR,需要收集患者樣本然后到專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗室去檢驗。因此,亟需能夠進(jìn)行實(shí)地檢測的快速裝置。
《PLOS Currents:Outbreaks》去年十二月發(fā)表的一項研究,開(kāi)發(fā)了一個(gè)能在3-7分鐘內鑒定MERS-CoV的便攜式RT-RPA裝置。在42°C條件下,等溫MERS-CoV RT-RPA與實(shí)時(shí)RT-PCR一樣敏感,可檢出10個(gè)RNA分子。文章指出,這個(gè)便攜裝置是監控MERS-CoV傳播,尋找其動(dòng)物宿主的理想方法。[參考文獻]
RPA檢測埃博拉等十種致命威脅
檢測傳染性疾病的綜合panel,有助于資源匱乏地區進(jìn)行實(shí)地分子診斷,對生物防御工作也有很大的幫助。
《Journal of Clinical Microbiology》雜志去年四月的一項研究開(kāi)發(fā)了一個(gè)RPA檢測panel,對土拉弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、天花病毒進(jìn)行RPA分析,對裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus)、埃博拉病毒、Sudan病毒和馬爾堡病毒進(jìn)行RT-RPA分析。研究顯示,這些RPA和RT-RPA的分析靈敏度大多在16-21個(gè)分子之間(與實(shí)時(shí)PCR相當),42°C下只需運行6-10分鐘,而且不存在交叉反應。[參考文獻]
RPA檢測HIV
在HIV診治中,即時(shí)檢測是非常重要的,對嬰兒來(lái)說(shuō)更是如此。有案例顯示,HIV感染后立刻進(jìn)行治療就能控制住患者體內的病毒,讓它們無(wú)法進(jìn)行復制。舉例來(lái)說(shuō),生來(lái)就攜帶HIV的密西西比嬰兒,在出生后立即得到了治療。后來(lái)這個(gè)孩子停藥了兩年多,病毒復制依然得到了控制。
目前嬰兒HIV診斷的金標方法是DNA PCR,但許多地區并不具備這樣的條件。在這種條件下,RPA技術(shù)正好可以大展身手。(四篇論文介紹了RPA在HIV檢測中的應用)[詳細]
RPA在癌癥研究中的應用
去年六月,新加坡A*STAR的研究團隊在Lab on a Chip雜志上,發(fā)表了一種能夠快速檢測癌癥單點(diǎn)突變的新技術(shù),等溫固相擴增/檢測(ISAD)。這是一種無(wú)需標記的實(shí)時(shí)檢測技術(shù),將基于硅基微環(huán)(silicon microring)的固相擴增與等溫重組酶聚合酶擴增(RPA)結合在一起。
去年十月,Talanta雜志上也發(fā)表了一項用到RPA技術(shù)的癌癥研究。該研究在超靈敏生物條碼分析(BBC)、適配體(aptamer)和RPA的基礎上,開(kāi)發(fā)了一個(gè)檢測細胞色素C(Cyto-c)的新生物條碼分析法(ABC)。細胞色素C是細胞死亡的重要標志物。(點(diǎn)擊鏈接查看這兩項研究的詳細報道和文獻)[詳細]
RPA全攻略之疑難解答
說(shuō)了這么多,你們肯定會(huì )有很多疑問(wèn),引物怎么設計?RPA反應能實(shí)現多重化么?RPA反應能對模板進(jìn)行定量么? RPA支持生物素或熒光標記的寡核苷酸么? RPA支持生物素或熒光標記的寡核苷酸么?以下就為大家一一解答。
RPA的擴增引物可以說(shuō)是整個(gè)反應的關(guān)鍵所在,那么怎樣才能設計好RPA引物呢?引物長(cháng)度怎樣選擇?引物序列有什么要求?擴增產(chǎn)物長(cháng)度有何限制?篩選的主要流程?答案詳見(jiàn)《RPA:引物與探針的常見(jiàn)問(wèn)題》一文。此外,在該文中你還可以找到以下問(wèn)題的答案。
可以。RPA在同一個(gè)管中同時(shí)進(jìn)行多個(gè)擴增反應。不過(guò),多重化的引物組合需要精心設計,以便每個(gè)引物都能同樣有效的工作。需要注意的是,RPA反應的引物總量(nmol)不要超標太多。如果在一個(gè)反應中使用兩個(gè)以上的擴增引物,就應該控制不同引物的量。另外,我們應當事先考慮好檢測多個(gè)擴增事件的探針、設備以及熒光團的兼容性。
可以。擴增子達到可檢出水平的時(shí)間,依賴(lài)于反應起始時(shí)的模板量。初始模板的拷貝越多,擴增子就越快達到可檢出水平。不過(guò),這種定量需要精心的實(shí)驗安排,確保對照反應是同時(shí)開(kāi)始的。舉例來(lái)說(shuō),可以利用鎂離子的添加時(shí)間進(jìn)行控制。因為鎂離子一旦進(jìn)入體系,RPA反應就會(huì )開(kāi)始。
此外,較慢的擴增過(guò)程有助于更的定量。我們可以通過(guò)調整反應條件或引物設計來(lái)減慢RPA的反應速度。
可以。這樣比較的是反應開(kāi)始時(shí)的熒光和反應結束時(shí)的熒光,熒光增強意味著(zhù)發(fā)生了擴增。
支持。在RPA反應中,連有生物素或熒光團的引物與未修飾的引物表現差不多。據悉還沒(méi)有發(fā)現任何差異。
可以。插入性染料可以在RPA反應中進(jìn)行定量和監控。不過(guò),這種染料可以結合任何雙鏈DNA,會(huì )生成來(lái)自引物的假陽(yáng)性信號。由于RPA擴增在常溫下進(jìn)行,這種噪音會(huì )比PCR嚴重一些。
需要。RPA反應中的物質(zhì)會(huì )干擾瓊脂糖電泳,如果不進(jìn)行產(chǎn)物回收,跑出來(lái)的帶會(huì )出現拖尾。
小編寄語(yǔ)
小編其實(shí)對PCR還是蠻有陰影的,之前很多做分子生物學(xué)的朋友經(jīng)常說(shuō)的一句就是:“怎么又沒(méi)P出來(lái)!"PCR好像“承包"了核酸檢測似的。雖然小編現在不用做實(shí)驗室了,但是還是希望新技術(shù)可以對在科研一線(xiàn)的你們有幫助。